Sam a grandi à Glenview en Illinois, à l'extérieur de Chicago. Il étudie à la Glenbrook South High School, où il participe à un cours d'art dramatique et de théâtre. Il est également le chanteur principal d'un groupe au lycée. Il continue son apprentissage au Juilliard School.
Il débute sa carrière d'acteur dans des séries TV à succès. En 2001, on le voit dans Urgences, l'année suivante dans Dark Angel, Spy girls, Angel, la série dérivée de Buffy contre les vampires ou encore Star Trek : Enterprise.
En 2005, après de nombreuses apparitions dans des séries télévisées, on lui confie un rôle dans la série très populaire Battlestar Galactica. En 2006, il apparaît dans Bones, puis deux ans plus tard dans la saison 8 de Smallville. Depuis 2010, il tient un des rôles-titres de la série Being Human (US).
Sam Witwer s'est également fait capturer ses mouvements, prêtant ses traits au personnage Galen "Starkiller" Marek, pour les jeux vidéo Star Wars : le Pouvoir de la force en 2008, puis Star Wars : Le Pouvoir de la Force II en 2010. Il est possible qu'il incarne le même rôle dans Star Wars Underworld.
